ELISA方法現(xiàn)在已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于各種抗原和抗體測定。拋開試劑盒本身質(zhì)量外，我們在實驗中也有很多因素都會影響試驗的正常結(jié)果。其中最常出現(xiàn)的問題是顯色淡，靈敏度偏低、重復(fù)性不佳、假陽性結(jié)果和假陰性結(jié)果，不管出現(xiàn)什么樣的結(jié)果都會直接影響我們的實驗結(jié)果。下面來分析ELISA實驗非正常檢測結(jié)果產(chǎn)生的常見原因，并分析其解決辦法，以提高檢測質(zhì)量。
1、方法學(xué)的影響
ELISA 測定模式包括以下幾種: 雙抗體夾心法、間接法、雙抗原夾心法、IgM 抗體捕捉法、競爭抑制法, 其中競爭抑制法因受操作時差所引起的競爭等因素的影響, 結(jié)果重復(fù)性較差, 質(zhì)量較難控制。
2、試劑因素
試劑的選擇 檢測的原理均基于抗原抗體反應(yīng)。由于該反應(yīng)過程受多種因素的影響, 如普遍存在基質(zhì)效應(yīng)、交叉反應(yīng)等, 因而檢測結(jié)果難以溯源, 不同方法、不同試劑之間甚至同一試劑不同批號間結(jié)果均缺乏可比性。試劑質(zhì)量在很大程度上決定了檢測的水平, 因此在引入新項目之前必須對試劑進(jìn)行嚴(yán)格的評估。試劑的評估有以下幾個步驟: (1) 確定開展該項目的必要性; (2) 了解該項目現(xiàn)有的檢測方法和原理; (3) 在了解試劑的組成基礎(chǔ)上選擇多家試劑盒進(jìn)行比較,判斷標(biāo)準(zhǔn)參考方法或參考物質(zhì), 其次為臨床的滿意度及機構(gòu)的報告如各級室間質(zhì)量評價、CDC 報告等; (4) 定期對檢測結(jié)果進(jìn)行追蹤反饋直至最終認(rèn)可該試劑。
3、樣本因素
標(biāo)本干擾因素包括內(nèi)源性干擾因素和外源性干擾因素,前者包括類風(fēng)濕因子、補體、異嗜性抗體、自身抗體等, 后者包括標(biāo)本溶血、標(biāo)本被污染、標(biāo)本貯存時間過長、標(biāo)本凝固不全、冷凍標(biāo)本的反復(fù)凍融等。其中外源性干擾因素是我們在檢測過程中可以避免也是必須避免的因素, 而避免內(nèi)源性因素的干擾則主要通過選擇合適的試劑盒。在臨床中遇到少見的疑難病例時應(yīng)當(dāng)考慮到內(nèi)源性干擾因素的存在。以下對外源性干擾因素進(jìn)行簡要說明:
標(biāo)本溶血 要注意避免出現(xiàn)嚴(yán)重溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團, 其具有類過氧化物的活性, 因此, 在以辣根過氧化物酶(ho rseradish peroxidase,HRP) 為標(biāo)記酶的ELISA 測定中, 如果血清標(biāo)本中血紅蛋白濃度較高, 則其就很容易在溫育過程中吸附于固相, 從而與后面加入的底物反應(yīng)顯色。
ELISA 操作步驟復(fù)雜, 操作不當(dāng)將引起較大的誤差。以下敘述各個步驟中的影響因素。加樣器是一種比較精密的工具, 其在長時間使用時會因機械磨損或者推動桿內(nèi)附著血痂等原因造成加樣不準(zhǔn), 尤其是對于樣本量較大的臨床實驗室, 因此必須定期對加液器進(jìn)行維護(hù)和校準(zhǔn)。每次加不同的標(biāo)本時均需更換吸嘴, 以免發(fā)生交叉污染。加樣時速度不可太快, 避免將標(biāo)本加在孔壁上部, 并注意不要濺出或產(chǎn)生氣泡。加樣時還應(yīng)當(dāng)注意操作時差對結(jié)果的影響, 操作時差是指加入標(biāo)本、試劑及混勻時間的差異。操作時差在每個實驗中都存在, 尤其是手工操作, 日常檢測標(biāo)本多達(dá)幾百個,從加入第一個標(biāo)本到最后一個標(biāo)本, 需幾十分鐘, 加入試劑及混勻等均存在著前后時間差異, 使抗原抗體反應(yīng)和酶促反應(yīng)時間不一致, 操作時差對競爭法檢測的結(jié)果影響更大, 在加酶結(jié)合物和底物時可用定量多道。
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